三代全長轉錄組測序

完整的轉錄本包括了從5’端到3’端polyA尾的序列,長度集中分布在1-6kb。二代測序技術由于讀長較短,得到的測序片段需要拼接,得到的轉錄本可能會產生拼接錯誤和較多的嵌合體,從而不能得到完整的轉錄本。第三代測序技術Pacbio利用單分子實時測序技術(SMRT),由于其超長的讀長(平均15kb),無需拼接即可直接獲取完整的全長轉錄本,因此可得到更高質量的轉錄本,有利于mRNA結構的研究,如可變剪切、融合基因、等位基因表達等。因此,全長轉錄本的研究越來越熱門,發表的文章影響因子也比簡單用二代測序RNA-seq要高。

目前第三代測序儀器最主要是美國太平洋生物技術公司( Pacific Biosciences)的RS II和Sequel。Sequel也是基于單分子實時技術(Single Molecular, Real-Time, (SMRT))的最新測序平臺,其數據產出比RS II提高了約7倍,測序成本更低、項目周期更短。
利用Pacbio三代測序儀進行全長轉錄組的測序有以下優勢:
1.超長讀長:讀長最長可達到約80kb,平均8~15kb,輕松解決二代測序所不能解決的重復序列問題;
2.通量高:RS II平臺一個SMRT cell可產生約0.5~1Gb數據,而Sequel平臺一個SMRT cell可產生5~10Gb數據;
3.無GC偏好性:
4.直接檢測堿基修飾:可直接檢測各種類型的DNA甲基化。

應用領域
不同實驗處理后引起的可變剪切事件變化;
發育轉錄后調控機制;
生物體基因可變剪切形式;
研究癌癥發生中的融合基因。

技術路線

                                          

分析內容
無參

1.全長轉錄本分析:數據統計、CCS分析、reads分類、reads聚類與校正、序列去冗余
2.注釋:基因注釋結果、物種分布統計、Nr/KEGG/SwissProt/GO注釋
3.高級注釋:CDS預測、Pfam蛋白結構域分析、SMART蛋白結構域分析、轉錄因子分析、R-Gene分析、TMHMM跨膜螺旋結構預測等
4.結構分析:SSR、lncRNA分析、可變剪切分析

有參
1.全長轉錄本分析:數據統計、CCS分析、reads分類、reads聚類與校正
2.比對參考基因組
3.基因統計:基因表達結果、基因注釋結果、Nr/KEGG/SwissProt/GO注釋
4.基因結構分析:可變剪切分析、可變polyA分析、融合基因分析、lncRNA鑒定、SNP/InDel分析、轉錄因子分析、開放閱讀框分析

樣品要求
1.膠圖檢測:條帶清晰,無明顯降解,無DNA污染;
2.2100檢測:RIN值≥7.5,基線平整,200-1200bp 無峰帶;
3.總量≥10ug(兩次建庫);濃度≥300ng/ul;
4.OD260/280:1.6~2.2;OD260/230:1.4~2.5。

項目周期
標準流程完成時間為60個工作日

參考文獻
1.Gordon, S. P. et al. Widespread Polycistronic Transcripts in Fungi Revealed by Single-Molecule mRNA Sequencing.PLoS ONE 10, e0132628 (2015).
2.Sun L, Luo H, Bu D, et al. Utilizing sequence intrinsic composition to classify protein-coding and long non-coding transcripts[J]. Nucleic acids research, 2013, 41(17): e166-e166.
3.Li J, Haratalee Y, Denton M D, et al. Long read reference genome-free reconstruction of a full-length transcriptome fromAstragalus membranaceusreveals transcript variants involved in bioactive compound biosynthesis[J]. Cell Discovery, 2017, 3:17031.
4.Alamancos G P, Pagès A, Trincado J L, et al. Leveraging transcript quantification for fast computation of alternative splicing profiles[J]. Rna, 2015, 21(9): 1521-1531.
5.Li J, Haratalee Y, Denton M D, et al. Long read reference genome-free reconstruction of a full-length transcriptome from Astragalus membranaceusreveals transcript variants involved in bioactive compound biosynthesis[J]. Cell Discovery, 2017, 3:17031.

淑女派对免费试玩