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乳腺間質成纖維細胞在患乳腺炎奶牛中表現出的炎癥特異性變化

合作老師:西北農林科技大學 高明清

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研究背景
•纖維細胞( Fibroblasts)是乳腺基質細胞主要的組成部分,已被證明有免疫調節作用,在乳腺的生長發育過程中是關鍵的結構部件,在傷口愈合和機體清除病原微生物的過程中,成纖維細胞被感染過程中創傷組織釋放的一些物質激活,從而發揮哨兵細胞(sentinel cells)的作用。
•乳腺炎是一種由微生物感染引起的炎癥反應,牛乳腺炎被認為是奶牛中“最貴”的傳染病,對養殖業和相關乳制品行業均產生極大威脅。
•乳腺炎的發生是否使乳腺間質成纖維細胞產生炎癥特異性變化,尚未被證明。

研究目的
•比較患乳腺炎組(INFs)和未患乳腺炎組(NFs)奶牛乳腺纖維細胞在細胞形態、增殖、死亡、遷移過程中的差異;
•構建INFs和NFs乳腺纖維細胞兩個轉錄組數據庫,比較全基因組表達譜差異,進一步研究乳腺間質成纖維細胞在乳腺炎中發生的變化。
•通過體外共培養模型研究炎癥相關纖維細胞產生的變化及對正常上皮細胞的作用。

奶牛乳腺纖維細胞轉錄組研究思路

一、基礎研究
1.發現差異
在前期基礎研究中,作者通過健康奶牛(NFs)與患乳腺炎奶牛(INFs)乳腺組織切片\HE染色切片發現NFs組與INFs組存在差異。

2.能否與其它細胞區分?

健康奶牛(NFs)與患乳腺炎奶牛(INFs)

發現了兩組乳腺的差別,那么乳腺中的纖維細胞能否和其它細胞區分開呢?試驗結果證明,切片或間接免疫熒光試驗能明顯區分鑒別上皮細胞與INFs細胞和NFs細胞,為后續試驗分離樣品做好準備。

二、NFs與INFs差異比較

通過健康奶牛(NFs)與患乳腺炎奶牛(INFs)電鏡圖發現, INFs組與NFs組織形態相似,但包含更多溶酶體空泡。除此之外,二者之間還有哪些差異
為研究乳腺炎能否增強乳腺間質成纖維細胞的增殖,作者對NFs和INFs進行體外培養數天后分別檢測其增殖情況,發現INFs的增殖速度顯著高于NFs(Fig.B),但二者細胞凋亡比率一致(Fig.C)。

      

兩種肌成纖維蛋白的標志蛋白FAP蛋白(fibroblast activation protein) 和α-SMA 蛋白(alpha-smooth muscle actin )在INFs組表達量明顯增加。(Fig. D)

兩種炎性細胞因子IL-6和TNF-α都被檢測到在INFs細胞中表達量升高。(Fig. E)

上述結果說明,相比健康奶牛在患乳腺炎的奶牛乳腺中,乳腺間質成纖維細胞會有明顯變化。并且能夠通過電鏡切片、增殖情況、凋亡情況區分NFs和INFs細胞。

三、轉錄組研究
成功分離INFs和NFs后,作者對它們進行了轉錄組研究。

1.1測序組裝結果統計

未患病組NFs:獲得12,167,245條reads,670條unigenes
患乳腺炎組INFs:獲得12,165,544條reads,763 條unigenes
NFs與INFs共表達基因:12841條

并統計了差異表達基因中,相比NFs組,INFs組上調(372)和下調(355)的基因。

1.2 Unigene的GO功能分析
GO功能富集分析發現DEGs在3大類別,包括細胞外基質、組織形成、調節發育代謝過程等10個功能上顯著富集。

1.3 Unigene的KEGG代謝通路結果分析
通過Pathway分析將618個DEGs注釋到228條代謝通路,以Qvalue<0.05過濾出14條顯著富集的代謝通路。

隨后在富集結果基礎上做出富集因子散點圖(注釋到該通路上的DEGs數量與注釋到其上的所有基因數量之比即為富集因子值)。

發現Unigene多存在于細胞融合粘附、免疫應答和生物合成與代謝三條主要通路。

1.4 DEGs深入分析

                                  

基于GO分析和KEGG pathway分析,作者選出細胞外基質重構、細胞融合粘附和免疫應答三方面的DEGs,對它們進行深入分析。A.纖維細胞在組織分化形成過程中,主要負責細胞外基質(ECM)的合成重構,可作為炎癥反應的“哨兵細胞”。對20個ECM重構相關DEGs進行熱圖聚類分析。結果顯示,相比NFs組,INFs組中LAMA2,LAMC2,ITGBL1,ITGA9基因均顯著上調表達;COL4A1基因下調表達。

基于GO分析和KEGG pathway分析,作者選出細胞外基質重構、細胞融合粘附和免疫應答三方面的DEGs,對它們進行深入分析。B. 對42個細胞融合粘附相關DEGs進行熱圖聚類分析。結果顯示,相比NFs組,INFs組中FER1L6,TUBB4A,AHNAK2,Fbp20基因均顯著上調表達;GUCY1B3,PLCB4,PRKCQ,MYH6,CLDN1基因下調表達。

基于GO分析和KEGG pathway分析,作者選出細胞外基質重構、細胞融合粘附和免疫應答三方面的DEGs,對它們進行深入分析。C.免疫應答相關的39個DEGs大部分屬于參與炎癥反應的生長因子、細胞因子、趨化因子或其相應的受體,例如CXCL12,C-C motif,CCL5 ,CFB,FAS等。

上述結果進一步說明,乳腺炎的發生,會誘導奶牛乳腺間質纖維細胞產生炎癥特異性的改變。

四、RT-PCR驗證
1.5 RT-PCR驗證RNA-seq
為檢驗RNA-seq結果準確性,作者隨機挑選19個DEGs進行RT-PCR驗證實驗。結果顯示與RNA-seq一致。

五、INFs功能驗證試驗
胸腺上皮細胞是乳腺最主要的細胞成分,作者為了進一步驗證患乳腺炎奶牛乳腺中分離的纖維細胞是否會對上皮細胞的功能特性產生影響,將健康奶牛乳腺中提取的上皮細胞分別與INFs和NFs細胞進行體外共培養。結果顯示:

在間接共培養模型中,相比NFs組,INFs能夠顯著抑制上皮細胞的增殖。

在以NFs或INFs為培養基的情況下,上皮細胞凋亡率一致。

在上皮細胞間接共培養模型中,相比NFs組,INFs能夠顯著抑制β-casein蛋白的表達。(Fig.C)

在上皮細胞間接共培養模型中,相比NFs組,INFs能夠在mRNA水平和蛋白水平上調TNF-α和IL-8的表達,但不影響IL-6的表達。(Fig.D)

INFs功能實驗證明,INFs細胞對乳腺上皮細胞的生物學特性及功能均能產生影響。

結果
1. 從患乳腺炎奶牛乳腺中提取到的乳腺間質纖維細胞會產生炎癥特異性變化,是重要的炎癥細胞并參與疾病進程;
2. 纖維細胞產生的炎癥特異性變化包括:溶酶體空泡增加、增殖能力增強、上調炎性相關基因、顯著的抑制了上皮細胞的增殖和β酪蛋白的分泌,并且上調上皮細胞中的細胞因子TNF-α 和 IL8。
3. 纖維細胞可以作為治療乳腺炎的靶細胞進行更深入的研究。

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